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三丁酸甘油酯平板透明圈法筛选脂肪酶高产菌株，根据菌株的形态特征、生理生化特性及分子生物学特征鉴定高产菌株，再用酸碱滴定法定量测定脂肪酶活性，该菌株硝酸盐还原为阳性，可以水解淀粉和液化明胶。 基于16SrDNA的系统发育分析结果表明，SLB-1菌株与登记号NR116240的甲基营养型芽孢杆菌处于最小分支，因此SLB-1菌株与甲基营养型芽孢杆菌相同本研究分离鉴定脂肪酶产生菌Bacillus  methylotrophicus  SLB-1，该菌产生的脂肪酶为中性常温酶.脂肪酶产生菌株的筛选、鉴定。 采集富含油的水样，用罗丹明 B培养基进行初筛，形态观察、生理生化试验和16S  r  DNA序列分析相结合进行菌种鉴定，构建了系谱树。 结果筛选了一株产生脂肪酶的细菌U5，鉴定为枯草[0x4e  22 ]。

通过单因素试验和响应面试验设计对发酵培养基中的三丁酸甘油酯、葡萄糖、尿素添加量进行发酵优化。 结果表明，最佳发酵培养基组分为： 三丁酸甘油酯2.0%(V/V  )、葡萄糖9 g/L、尿素8 g/L。 在该优化条件下，粗脂肪酶酶活性为4.3 U/m  L，比优化前的酶活性提高了16.22%。 综合考虑密码子嗜好性、RNA稳定性及自由能等因素，优化疏松棉状嗜热丝孢霉(tll  )耐热脂肪酶(tll  )基因序列，合成全部基因。

将合成的tll基因连接到克隆载体上，将亚克隆连接到表达载体pHGWPT-tll上，通过根癌农杆菌对被孢霉sh2进行了转化。 经过三丁酸甘油酯平板、SDS-PAGE及Western  Blotting鉴定，tll基因表达成功。 发酵72h，转化子脂肪酶的活性最大为36U/mL。

转化体通过等离子体变异得到的变异株脂肪酶的活性比出发株提高了约37%。 本研究将人工合成的RML基因RML克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K，构建pPIC9K-rml诱导型表达载体。 表达载体被线性化转化为巴斯德毕赤酵母GS115，用抗生素G418筛选，用三丁酸甘油酯mm板及PCR法筛选阳性重组工程菌。 工程菌发酵液经SDS-PAGE分析、三丁酸甘油酯板鉴定，脂肪酶RML在毕赤酵母中有效表达，显示蛋白分子大小如预期。 进一步优化了包括培养基组分、诱导剂浓度、发酵温度等优化在内的发酵条件。

优化的培养基组为： 甘油 4.0%，(NH4)2SO45.000 g/L，CaSO40.465 g/L，K2SO49.100 g/L。 培养条件采用：pH值6.0，生育阶段温度30，诱导阶段采用22低温诱导，诱导期每24 h补充甲醇浓度3%。 优化后，发酵液中RML的活力最高为116 U/ml，比优化前提高3.14倍。

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